深海魚成分のスフェロイド培養液(三次元培養)の製造・販売

 スフェロイド培養液(ノロゲンゲ抽出液)の性質

マイクロプレートの形とHA-Matrix添加における5-FU感受性変化

 

HAーMatrixは、接着系プレートでもスフェロイド形成をします。

平底(F)では多数のスフェロイド、丸底(U)、V底(V)では1つのスフェロイドを形成することができますが、5-FUへの感受性がプレートの形や細胞数によって違ってきます。

 

マイクロプレートの形(U底、V底)とHA-Matrixによるスフェロイド化

 

 

 スフェロイド培養液(ノロゲンゲ抽出液)の性質

 

ノロゲンゲ抽出液はガン細胞(HepG2細胞)などの細胞(トリプシン処理)培養時に添加するとディッシュ底面で細胞が集合するという特性を示します。

 

◆HepG2細胞のタイムラプス顕微鏡画像

・ノロゲンゲ抽出液を加えると、細胞はシャーレ底面で活発に動き回るようになります。

・数時間後には、細胞同士が集合する様子が顕著に観察されます。

 

96穴マイクロプレートでのHepG2細胞の形態の変化

 

ノロゲンゲ抽出液(5%添加)【培養時間は左から0hr 12hr 24hr 48hr】

 

ノロゲンゲ抽出液 (無添加)【培養時間は左から0hr 12hr 24hr 48hr】

 

◆抽出液濃度とスフェロイドの特性

 

・細胞はノロゲンゲ抽出液の添加で、シャーレ底面で段々と集合し、台形のような集合形状となり、その後、細胞の増殖と共に集合体が半球の形状に近づいていきます。

 

・ノロゲンゲ抽出液の添加量を多くするほど、スフェロイドは明確になり、スフェロイドの高さも高くなります。

HepG2細胞のスフェロイド形成

☆初期の細胞集合が速い

細胞数 5X103/100μl 96穴マイクロプレート

 

スフェロイド高さの測定方法

・8穴ガラスチャンバーに、0,2,6,10%ノロゲンゲ抽出液を

 通常のDMEMで調整し、125μL加えておく。

 

・HepG2細胞を2×105細胞/mlに調整し、

 上記穴に125μLずつ加え、軽く混ぜる。

 

・3日後と7日後に高さを測定→HepG2細胞は自家蛍光が

 強く、そのまま蛍光顕微鏡で観察ができる。

 

・高さの測定は、コンフォーカル顕微鏡を使用。

 Z軸を移動しての検鏡で、蛍光が消える上限と下限値を

 測定して、高さを解析した。

ノロゲンゲ抽出液添加によるHepG2細胞のスフェロイド高さの変化

◆スフェロイド形成とCYP3A4の増加

薬物代謝研究への応用 → ノロゲンゲ抽出液を添加した場合、CYP3A4が増加する傾向が観察されます。

 

ノロゲンゲ濃度(%)

ノロゲンゲ抽出液がCYP3A4へ及ぼす影響

 

デキサメサゾンがCYP3A4へ及ぼす影響

CYP3A4測定方法・・・promega P50 Glo assay (luciferin-IPA)を用いた

・HepG2細胞を1×10細5胞/ml、標記ゲンゲ抽出液濃度で96穴マイクロプレートで3日間培養し、スフェロイドを形成させた。

・Luciferin-IPA 3μMを通常DMEM培地で調整し、50μL分を培地交換した。

・(non-lytic)37℃、60分、CO2インキュベーターで培養し、上清25μLをホワイトプレートに移し、等量の検出試薬を混和して室温で20分反応させた後にルミノメーターで測定した。

・(lytic)50μLの検出試薬を添加し、5分マルチプレートシェイカーで混和した。

 室温で20分反応させた後、ホワイトプレートに移し、ルミノメーターで測定した。

・デキサメサゾン(DEX)はCYPの誘導剤として用い、HepG2のCYP3A4がどこまで誘導できるかを調べたもの。

 2日間DEXで培養し、上記と同様の方法でCYP活性を測定した。

 VehicleにはDEXを溶解している100%エタノールを等量加えている。

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